冷凍干燥是將需要干燥的藥液預先冷凍成固體的干燥方法。并在低溫低壓條件下直接升華以除去冷凍狀態的水，而不需要經過液態。由于整個操作過程處于低溫狀態，因此該方法特別適用于熱敏性蛋白藥物制劑的制備。凍干后的蛋白藥物呈松散狀，不僅有利于保存，而且有利于蛋白藥物復溶后的復性。

顯然，凍干技術為理化性質不穩定的蛋白質藥物的制備提供了有效的方法。然而，凍干過程是一個復雜的相變過程。藥物在冷凍、凍融、干燥、儲存過程中引起蛋白質變性的因素有很多。因此往往需要使用一些保護劑來穩定處方中的蛋白質。冷凍保護劑種類繁多，作用機制也復雜。本文將對蛋白質凍干產品的保護劑進行綜述。

在凍干制品的整個生產過程中，存在著多種應力，包括低溫應力、冷凍應力、干燥應力等。這些應激往往是直接或間接導致蛋白藥物不穩定的因素。根據抗應激保護劑的不同，蛋白質保護劑初步分為冷凍保護劑和凍干保護劑。優秀的蛋白質保護劑不僅可以在整個凍干過程中保護蛋白質藥物，而且可以抑制蛋白質藥物在成品儲存期間的變性。由于蛋白質藥物在儲存過程中的變性速率往往大于冷凍干燥過程中的變性速率，大多數在溶液中有效的蛋白質冷凍保護劑對干燥蛋白質沒有保護作用，甚至會加速蛋白質藥物的不穩定比例。

為了擴大保護作用，需要在凍干產品中使用兩種以上的保護劑，如多羥基化合物、糖、蛋白質、聚合物、氨基酸、鹽、胺、表面活性劑等。

1.多羥基化合物

多羥基化合物長期以來被用作蛋白質的防凍劑。常見的凍干保護劑有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇等。甘油可以促進凍干過氧化氫酶的復性。而當甘油濃度升至0.8%時，過氧化氫酶即可全復性。在某些處方中，甘露醇可以作為蛋白質的凍干保護劑。甘露醇對蛋白質的保護作用與其濃度、形態、結構有關，其濃度有時與晶體形態有關。一般認為，無定形甘露醇具有穩定蛋白質的作用，而結晶甘露醇則失去保護功能。1%或更低濃度的甘露醇通過形成無定形結構阻止蛋白質藥物的聚集，但高濃度的甘露醇容易形成結晶態促進蛋白質藥物的聚集。

2.糖

糖是最常見和廣泛使用的凍干保護劑類型。它是蛋白質的非特異性穩定劑，在凍干的各個階段都能對蛋白質藥物起到一定的保護作用。糖的保護作用與其類型有關，蛋白質和雙糖是研究最多也有效的保護劑，其中蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖組成的二糖，化學性質穩定，結構無定形。對于阻斷蛋白質二級結構的變化，冷凍干燥過程和延長儲存期間蛋白質的延伸和聚集發揮著重要作用。

與蔗糖相比，海藻糖的玻璃化轉變溫度較高，吸濕性較低，無還原性。這些優點都表明海藻糖可能具有更廣闊的應用前景。與小分子糖相比，大分子糖似乎對蛋白質提供的保護較少。許多研究表明，高分子量的多糖并不是凍干保護劑的選擇。

但一些研究卻顯示出相反的結果，如大分子量菊粉研究表明，聚合度為5.5-6.0的菊粉對堿性磷酸酶的保護作用明顯高于海藻糖和低聚合度的菊粉。這說明多糖的保護作用不能一概而論。

特別是在儲存期間，右旋糖酐或多糖可以提高產品的玻璃化轉變溫度，防止蛋白質因產品崩解而被破壞。葡萄糖在凍干過程中可以部分保持無定形形式，這對某些蛋白質藥物有一定的保護作用，但需要注意的是，應謹慎選擇以葡萄糖為基礎的還原糖作為蛋白質保護劑。糖對蛋白質的保護作用有時取決于其濃度。

通常，糖的保護作用在一定濃度范圍內隨著濃度的增加而增強。當達到一定濃度時，保護作用達到最大值，然后增加糖的濃度，保護作用不再明顯增加，有時反而會降低。關于糖發揮最大保護作用時的濃度有不同的報道。

例如，100mmol/L蔗糖對B-半乳糖酶具有最佳保護作用，而對磷酸果糖激酶提供最大保護作用的海藻糖濃度為300mg/ml。已報道的可實現最大穩定的低糖濃度是足夠的在蛋白質表面形成單分子層。

事實上，糖對蛋白質的保護作用不僅取決于糖的總體濃度，還取決于兩者的比例。有研究發現，當α-D-吡喃甘露糖、乳糖、海藻糖、纖維二糖與重組人生長激素的摩爾比為131:1時，它們都能100%占據重組人生長激素上的強水結合位點和弱水結合位點，提供最佳保護效果。當摩爾比達到300:1和1000:1時，糖對重組人生長激素的保護作用不再增加，并且在某些處方中保護作用會降低。

糖的還原特性和其他特性也會影響其對蛋白質的保護作用。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖和其他還原糖可與蛋白質中暴露的某些氨基酸殘基發生麥拉德反應（氨或棕色反應）。會使產品變黃并降低蛋白質活性。不同旋光度的麥芽糖糊精在凍干過程中對乳酸脫氫酶的保護作用表現出很大差異。

目前用作蛋白質保護劑的糖包括葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、纖維二糖、甘露糖、麥芽糖、肌醇、白糖、菊粉、葡聚糖、麥芽糖糊精、麥亞多糖、肝素、2-羥丙基-B環糊精和很快。雖然糖可以為大多數蛋白質提供可靠的保護，但并不是所有的蛋白質都能受到糖的保護，這仍需要更細致和深入的研究。

3.氨基酸

氨基酸是常見的蛋白質保護劑之一。在冷凍過程中，低濃度的甘氨酸可以通過抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結晶引起的pH值變化來防止蛋白質藥物的變性。無定形形式的甘氨酸可以防止重組人生長激素在冷凍干燥過程中聚集。結晶甘氨酸可提高成品的崩解溫度，防止崩解引起的蛋白質藥物的破壞。常用的氨基酸蛋白保護劑有脯氨酸、色氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、鹽酸賴氨酸、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。

4.聚合物

聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、明膠、聚乙烯亞胺和其他聚合物也常用作蛋白質的冷凍保護劑。一般來說，聚合物的穩定效果取決于聚合物的多種性能。不同聚合度和濃度的聚合物提供不同的保護。例如，聚合度高的PVP具有較高的玻璃化轉變溫度。隨著PVP濃度和分子量的增加，水溶液的粘度會增加，蔗糖的玻璃化轉變溫度會顯著升高，這也增加了冷凍過程中對蛋白質的保護。

但聚合度太大時，聚合物會在冷凍過程中結晶，失去對蛋白質的保護作用。過高的濃度和分子量會增加最終產品的水分，使產品中的蛋白質更加不穩定。右旋糖酐40對豬胰蛋白酶的穩定作用比右旋糖酐80更強，表明適當的聚合物鏈長有利于胰蛋白酶的穩定性。

5.蛋白質

蛋白質保護劑可分為兩類：一類是蛋白質藥物，另一類是外來蛋白質。一些蛋白質凍融后的活性與蛋白質的初始濃度直接相關。初始濃度的增加有時會促進蛋白質的復性。

常用的外來蛋白質保護劑是血清白蛋白，它是一種經典且優異的蛋白質穩定劑。例如，1%牛血清白蛋白可以防止兔肌肉乳酸脫氫酶水溶液在冷凍時失去活性。人血清白蛋白在較低濃度（0.05%-0.1%）下能有效阻止蛋白質表面的吸附，對凍干過程中對數蛋白質有保護作用。但由于血清白蛋白潛在的血源性病原體污染限制了其在蛋白質產品中的應用。重組人白蛋白已被推薦作為血清白蛋白的替代品。

6.其他

一些表面活性劑（Tween 80、Bridger、Pluronic、十二烷磺酸鈉）可以在冷凍機干燥過程中對蛋白質起到一定的保護作用。在一些凍干產品中，添加鹽和胺可以獲得特定的蛋白質穩定效果。不同類型的保護劑組合可以得到穩定性更好的凍干產品。

如何獲得穩定的凍干蛋白產品，選擇合適的保護劑非常重要。那么如何選擇合適的防護劑呢？首先我們要對所要保護的蛋白藥物的理化性質有充分的了解，然后通過實驗找出導致蛋白藥物在凍干過程和儲存過程中不穩定的因素，然后針對這些不穩定因素選擇具體的防護劑。一般來說，糖和多羥基化合物是常用的凍干保護劑。其中，蔗糖、海藻糖等二糖對某些蛋白質能表現出良好的保護作用。

優秀的凍干保護劑應具有多種保護性能，如高玻璃化轉變溫度、低吸濕性、低結晶率、不含還原基團等。但任何單一的保護劑不可能具備所有的保護特性，因此有時必須考慮2種或多種保護劑來穩定蛋白質藥物。

結論

隨著生物技術的快速發展，越來越多的蛋白質藥物被開發出來。迄今為止，除了采用冷凍干燥技術外，還沒有更有效的制備方法來制備更穩定的蛋白質產品。即使采用凍干技術制備某些蛋白質產品，仍然需要一些有效的輔助方法，例如添加凍干保護劑以增加蛋白質穩定性。近年來，凍干保護劑及其保護機制的研究更加深入。尤其是蛋白質分析方法的改進，為蛋白質保護劑的研究提供了便利。

計算機技術在凍干過程中的應用，使得能夠建立相應的數學模型來模擬和分析物料在凍干過程中的真實狀態，這也使得凍干技術得以改進和提高。但蛋白質穩定機制相當復雜，蛋白質凍干產品的研究有待進一步深化。開發更好的凍干保護劑和提高蛋白藥物凍干產品的質量仍然是當前生物技術藥物研究的重點和方向。