一、鄰位連接技術（PLA）的工作原理？

 Duolink®鄰位連接技術(PLA)是一種高特異性、高靈敏地原位檢測內源性蛋白、蛋白修飾和蛋白互作的強大工具.該技術可輕松檢測和定位未改造細胞和組織內單分子級別的蛋白靶標。一般先使用不同種屬來源的兩種一抗檢測兩個蛋白靶標（圖1A）。接著用一對寡核苷酸標記的二抗（PLA探針/鄰位探針）結合一抗（圖1B）。再加入連接寡核苷酸，當一對鄰位探針足夠貼近時，連接寡核苷酸會與鄰位探針對互補雜交，在連接酶的作用下形成封閉的環狀DNA，作為滾環擴增(RCA)的模板（圖1C）。接著DNA聚合酶以PLA探針為引物，以上述環狀DNA為模板，通過RCA反應合成連環序列（圖1D）。這使仍與PLA探針相連的序列信號擴大1000倍，方便進行信號定位。最后，用標記寡核苷酸與擴增子內的互補序列雜交（圖1E），在熒光顯微鏡下表現為散點（PLA信號），實現可視化和定量分析（圖1F）。Duolink® PLA技術可結合免疫熒光（即綠色、紅色、遠紅或橙色檢測）或免疫組化（即過氧化物酶催化反應）檢測貼壁細胞、細胞離心涂片和組織切片。此外，Duolink® PLA技術還可結合流式細胞術檢測血液或懸浮細胞，也可采用多孔板（例如，96或384孔板）搭配高內涵篩選成像儀進行高通量分析。Duolink® PLA 的高特異性、靈敏度和多功能性使其成為信號通路分析、藥物篩選、IC50 測定和靶標驗證的理想選擇。

二、DUOLINK®鄰位連接技術檢測EGFR和HER2二聚化？

表皮生長因子受體（EGFR，ErbB1，HER1）和人表皮受體2（HER2，ErbB2，Neu）的二聚化是一種蛋白質相互作用（PPI）。EGFR和HER2是受體酪氨酸激酶ErbB家族的成員，在細胞分裂和死亡調控中起重要作用。影響其中任意一種蛋白質的表達或活性的突變與多種癌癥的發生發展有關。當配體（如EGF）結合EGFR的胞外結構域時，EGFR受體激活并自磷酸化細胞質尾區。從而與ErbB家族其他成員形成同源(EGFR-EGFR)和異源（例如，EGFR-HER2）二聚體（圖2）。二聚化及之后的磷酸化發生后，會募集一些銜接蛋白，進一步激活幾個胞內信號通路，最終可調節基因轉錄，導致腫瘤細胞的增殖、血管生成、侵襲、轉移和抗凋亡。