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| 問題 | 潛在原因 | 建議的解決方案 |
| 染色弱或缺失 | 細胞已從蓋玻片上脫落 | - 洗滌時更加輕柔或減少洗滌次數 |
| 細胞通透性較差 | - 嘗試增加 Triton X-100 的濃度 | |
| 細胞干涸 | - 確保在整個實驗過程中細胞始終被過量的液體覆蓋 | |
| 細胞過度固定 | - 減少細胞與固定劑一起孵育的時間 | |
| 一抗太少 | - 增加一抗濃度 | |
| 光照 | - 確保應用二抗后樣品永遠不會暴露在光線下 | |
| 二抗錯誤 | - 確保二抗對一抗的培養物種具有特異性 | |
靶細胞中不存在蛋白質 | - 檢查文獻以了解細胞群中是否預期存在蛋白質 | |
| 表位因固定而被遮蓋 | - 嘗試不同的固定劑 | |
| 曝光時間太短 | - 增加成像時的曝光時間和/或增益 | |
| 高背景 | 非特異性結合 | 嘗試在沒有一抗的情況下測試二抗，以確保二抗不會與細胞內的靶標結合 |
| 阻擋不良 | - 嘗試更換封閉液 | |
| 抗體濃度過高 | - 嘗試降低一抗濃度 | |
| 反應性醛基 | - 考慮在 PBS 孵育步驟中引入 1% NaBH4 | |
| 光譜重疊 | - 確保二抗的吸收/發射光譜不重疊 | |
| 洗滌不足 | - 增加二次孵育后的洗滌步驟 | |
| 非特異性染色 | 抗體與其他蛋白質中存在的表位結合 | - 嘗試不同的抗體，看看染色模式是否相關。 |
| 抗體濃度過高 | - 嘗試降低一抗和二抗濃度 | |
| 與內源性 IgG 的反應性 | - 嘗試使用在細胞來源以外的物種中產生的抗體（尤其是在原代細胞培養物中） |
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