臺盼藍(lán)在許多實驗室中是一種被認(rèn)可的細(xì)胞計數(shù)染料，但它具有致癌性、環(huán)境破壞性和細(xì)胞毒性。赤蘚紅 B，通常也稱為赤蘚紅、酸性紅 51 或 FD&C 紅 3 號，是一種生物安全且無毒的比色染料，可用作臺盼藍(lán)的替代品，用于細(xì)胞計數(shù)和活力評估.1使用赤蘚紅 B 染料排除法評估細(xì)胞活力的原理與臺盼藍(lán)類似，即完整的細(xì)胞膜可排除極性分子，而受損的細(xì)胞膜則不會。活細(xì)胞保持未染色，而死細(xì)胞被染色，外觀較暗。

本技術(shù)說明展示了使用 CellDrop 自動細(xì)胞計數(shù)儀使用赤蘚紅 B 作為臺盼藍(lán)的替代品作為細(xì)胞活力染色劑。本技術(shù)說明還將使用赤蘚紅 B 和臺盼藍(lán)的細(xì)胞計數(shù)與 DeNovix AO/PI 熒光檢測進(jìn)行了比較，后者是兩種染料（吖啶橙和碘化丙啶）的組合，經(jīng)過優(yōu)化，可在 CellDrop 上使用綠色和紅色熒光通道對有核細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)和活力評估。

赤蘚紅素 B 作為臺盼藍(lán)替代細(xì)胞活力染料的準(zhǔn)確性是通過在 PBS 中饑餓獲取死細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞與活細(xì)胞的各種混合物計數(shù)來確定的。將活力約為 12%（通過 AO/PI 評估）的饑餓 CHO 細(xì)胞與 95% 活細(xì)胞混合，結(jié)果表明，使用赤蘚紅 B 測定 CHO 細(xì)胞的活力與使用臺盼藍(lán)或 AO/PI（圖 1）測定培養(yǎng)細(xì)胞一樣有效。

Figure 1. CHO cells counted at different viabilities as determined on the CellDrop using Erythrosin B, Trypan Blue, and AO/PI methods. (A) Cell Viability, (B) Result image of CHO cells stained with EB, (C) Live Cells/mL, (D) Result image of CHO cells stained with TB, (E) Total Cells/mL, (F) Result image of CHO cells stained with AO/PI. Each bar represents an average of six (6) replicates per group. The error bars represent standard error of the mean (SEM) of the averaged replicates. (EB = Erythrosin B, TB = Trypan Blue, AO/PI = Acridine Orange and Propidium Iodide).

將活力低于 20% 且碎片水平高的 Jurkat 細(xì)胞也與 70% 至 30% 的高活力細(xì)胞混合。結(jié)果顯示，三種 （3） 細(xì)胞活力染色劑之間的活細(xì)胞、混合細(xì)胞和死細(xì)胞的計數(shù)和活力分別相似（圖 2）。

Figure 2. Jurkat cells counted at different viabilities as determined on the CellDrop using Erythrosin B, Trypan Blue, and AO/PI methods. (A) Cell Viability, (B) Live Cells/mL. Each bar represents an average of eighteen (18) replicates per group.The error bars represent standard error of the mean (SEM) of the averaged replicates. (EB = Erythrosin B, TB = Trypan Blue, AO/PI = Acridine Orange and Propidium Iodide).

圖 3 顯示了將制備的中低活力 Jurkat 傳代稀釋至三 （3） 細(xì)胞密度后獲得的活力數(shù)據(jù)（圖 3）。細(xì)胞活力檢測結(jié)果在所有細(xì)胞密度和三種活力染色劑之間保持一致，而細(xì)胞數(shù)量保持稀釋樣品中預(yù)期的分離度。

Figure 3. Medium viability Jurkat cells counted at different densities as determined on the CellDrop using Erythrosin B, Trypan Blue, and AO/PI methods. (A) Cell Viability, (B) Result image of Jurkat cells stained with EB, (C) Live Cells/mL, (D) Result image of Jurkat cells stained with TB, (E) Total Cells/mL, (F) Result image of Jurkat cells stained with AO/PI. Each bar represents an average of five (5) replicates per diluted sample. The error bars represent standard error of the mean (SEM) of the averaged replicates. (EB = Erythrosin B, TB = Trypan Blue, AO/PI = Acridine Orange and Propidium Iodide).

材料和方法

通過在室溫下在 PBS 中饑餓殺死 CHO 和 Jurkat 細(xì)胞，并按每種細(xì)胞類型特定的預(yù)定時間長度殺死。將 CHO 細(xì)胞分為四 （4） 組：活細(xì)胞，50% 活細(xì)胞與 50% 饑餓細(xì)胞的混合物，另一種 70% 饑餓細(xì)胞與 30% 活細(xì)胞的混合物，以及饑餓細(xì)胞;而 Jurkat 細(xì)胞被分成三 （3） 組：活細(xì)胞、每種細(xì)胞類型的饑餓細(xì)胞和活細(xì)胞混合比例為 70-30% 的組，以及饑餓細(xì)胞。使用赤蘚紅素 B 、 臺盼藍(lán)和 AO/PI 測量每組的活力。

為了確認(rèn)赤蘚紅 B 在不同密度下與臺盼藍(lán)和 AO/PI 相比的準(zhǔn)確性，將來自一周齡傳代的低活力 Jurkat 細(xì)胞稀釋成三種濃度（高、中和低濃度），并在 CellDrop 自動細(xì)胞計數(shù)儀上使用赤蘚紅 B、臺盼藍(lán)和 AO/PI 進(jìn)行計數(shù)。

將研究中的三種染料制備至以下最終濃度。臺盼藍(lán)（Sigma 貓 #T8154） – 0.4% w/v. 赤蘚紅素 B（Sigma 貓 #198269）0.02% w/v 的 PBS 溶液，以及 AO/PI（DeNovix 貓 #CD-AO-PI-1.5）0.0005% w/v。每種都用于制備與細(xì)胞懸液的 1：1 稀釋液。在計數(shù)前立即將每種染料添加到細(xì)胞樣品中，并在加載到 CellDrop 上進(jìn)行測量之前將樣品輕輕混合。

使用臺盼藍(lán)應(yīng)用程序?qū)ε_盼藍(lán)和赤蘚紅 B 染色的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。Normal exposure（正常曝光）設(shè)置用于臺盼藍(lán)計數(shù)。自定義曝光向?qū)в糜谧詣哟_定 0.02% 赤蘚紅素 B 的最佳曝光。使用 CHO 臺盼藍(lán)應(yīng)用程序方案對臺盼藍(lán)和赤蘚紅 B 染色的 CHO 細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，使用 Jurkat 臺盼藍(lán)應(yīng)用程序方案對臺盼藍(lán)染色的 Jurkat 細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。該方案經(jīng)過修改以計數(shù)用赤蘚紅素 B 染色的 Jurkat 細(xì)胞。將赤蘚紅素 B 染色的 Jurkat 細(xì)胞的染色閾值從 30 個修改為 25 個，活圓度和死圓度從 65 和 20 分別修改為 35 個和 15 個。AO/PI 應(yīng)用程序用于熒光計數(shù)，并應(yīng)用了標(biāo)準(zhǔn) CHO 和 Jurkat AO/PI 方案和建議。

數(shù)據(jù)顯示，赤蘚紅 B 是臺盼藍(lán)細(xì)胞明場計數(shù)的有效替代品。 將這些明場結(jié)果與熒光 AO/PI 方法進(jìn)行比較，可以參考一種特定于有核細(xì)胞且忽略樣品中存在的碎片的方法，表明細(xì)胞系樣品的所有三種活力測定方法都是一致的。所提供的數(shù)據(jù)表明，赤蘚紅 B 可以可靠地替代更危險且對環(huán)境更具破壞性的臺盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，而無需額外的硬件。