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| 品牌 | 其他品牌 | 貨號 | M3029 |
|---|---|---|---|
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 化工,生物產業,制藥/生物制藥 |
輕松跟蹤移液步驟
穩健的性能 – 高度穩定的 PCR 預混液
菌落篩選 – 針對快速篩選進行了優化
無需額外步驟 – 已包含上樣緩沖液
方便的規格 – 1.5 mL 等分試樣大小，易于作
含紅色染料的 PCR MasterMix，用于移液步驟的視覺控制：PCR 后，無需添加電荷緩沖液即可進行電泳。這使得該 PCR 預混液 （2x） 節省了時間和成本。含紅色染料的 PCR RedMasterMix （2x） 還具有高度特異性的特點，可獲得最佳結果。
PCR MasterMix （2x） 是以下成分的優化（即用型）混合物：
- Taq DNA 聚合酶
- dNTP
- MgCl2
- 紅色染料
- 反應緩沖液
用于使用 PCR 高效擴增 DNA 模板。您所要做的就是添加引物和模板 DNA。同時，PCR 預混液含有添加劑和紅色染料，這使得無需添加電荷緩沖液即可進行后續電泳。該 PCR RedMastermix 專為擴增子長度達 4 kb 的常規 PCR 而開發。緩沖液的特殊成分保證了即使在反復解凍和冷凍循環后也能獲得可重復的結果。
含 Red 染料的 PCR 預混液以 1.25 mL 的方便等分試樣運輸。
我們的 RedMastermix 也可用于 Sanger 測序。為此，請在 PCR 后以 1：8 的比例稀釋 PCR 混合物，或用離心柱純化，然后應用。
規格：
用于 PCR 的 2 次即用型預混液，包括用于更好地觀察移液的紅色染料和凝膠上樣染料。已包括 dNTP、緩沖液和 DNA 聚合酶。
方便的等分試樣大小：1.25 mL。該預混液在 +2°C 至 +8°C 下可穩定保存至少 8 個月。
用于小鼠尾巴的可靠 PCR。用于 Sanger 測序反應。
One unit is defined as the amount of enzyme which will convert 10 nmoles of dNTPs to an acid-insoluble form in 30 min at 72°C under the assay conditions (25 mM TAPS (tris-(hydroxymethyl)-methyl-amino-propanesulfonic acid, sodium salt) pH 9.3 (25°C); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 1 mM b-mercaptoethanol; and activated calf thymus DNA as substrate.
synthetic
eclass-Nr: 32-16-05-02
技巧
對于每個模板/引物對，必須憑經驗評估最佳反應條件，例如通過改變引物與模板的比例或離子強度（使用 MgSO4）和循環參數（時間和溫度）。
DNA 模板
GENAXXON Red 預混液特別適用于不太干凈的鼠尾 DNA
關于 10E4需要靶 DNA 的拷貝才能在 25-30 個循環后獲得可檢測的產物。
使用 1pg–1ng 質粒 DNA 或病毒 DNA。
使用 1ng–1 μg 用于基因組 DNA。
較高的 DNA 濃度會降低擴增子特異性，并導致額外的條帶，尤其是當使用大量循環時。
如果需要較少的循環次數，例如為了提高特異性，可以使用更高的 DNA 濃度。
底漆
一般來說，這些應該有 20-30 個核苷酸的長度。
理想的 GC 含量為 40-60%。
GC 堿基應盡可能均勻地分布在引物上。
引物對的兩種引物的熔解溫度相差不應超過 5°C。
避免引物內的二級結構（例如發夾）以及所用引物對之間潛在的二聚化區域。
如果將轉基因位點（側面定向誘變）摻入引物中，那么最好在距離側面定向誘變位點 5' 處插入 4-6 個額外的堿基，以便引物可以在正確的位置退火。
每種引物的最終濃度應在 0.05-1 μM 之間（0.05 μM 是下限），典型值在 0.1 至 0.5 μM 之間。
較高的濃度會導致引物二聚化增加，并“產生"或模擬假擴增產物。
在引物和探針的情況下，可以假設隨著引物量的增加，PCR 一開始當然也會運行得更好（通常一開始會預期 Ct 值會更早）。然而，隨著濃度的持續增加，PCR 達到飽和。除了略低的 Ct 值外，熒光信號通常也在開始時以較高的引物/探針濃度被放大。
此外，可以添加一個或多個探針（應始終充分測試必要的濃度）。我們建議在 50-500 nM 之間。在這方面，應測試不同的組合。
鎂濃度
1.5-2.0 mM Mg2 + 是 Taq DNA 聚合酶作用的選擇，但最佳 Mg2 + 濃度在很大程度上取決于模板、緩沖液組成、DNA 量以及 dNTP，因為后兩者尤其具有螯合鎂的高傾向，從而將其從 PCR 反應中吸收。
如果 [Mg2+] 太低：不可見 PCR 產物。
如果 [Mg2+] 過高：可以看到不需要/不正確的 PCR 產物。可能只能看到涂片。
脫氧核苷酸 （dNTPs >）
典型濃度為 200 μM 每個單獨的 dNTP。然而，原則上，200-400 μM 的 dNTP 是 PCR 的良好濃度。
50-100 μM 的較低濃度會增加特異性，但在某些情況下會顯著降低產量。
較高的濃度會增加產量，尤其是對于長擴增子，但會顯著降低特異性。
DNA 聚合酶
選擇正確的聚合酶取決于預期用途和所使用的模板（標準 PCR：高準確度的 Taq DNA 聚合酶 S >，高產量的 Taq 聚合酶 E >;預混液：標準 PCR MasterMix > 或 Red MasterMix >含紅色染料）。
對于多重 PCR，有特殊的凍干多重 MasterMixe >。
為了提高特異性或對于困難的模板，建議使用熱啟動應用程序。為此，>有特殊的熱啟動聚合酶。
對于用于克隆或其他需要低錯誤率的方法的 PCR，熱穩定的高保真校正聚合酶，如
Pfunds >、ExactRun >、ReproFast > 或 ReproHot （KOD） 校正聚合酶>。這些酶在擴增過程中的錯誤要少得多，并增加了無錯誤擴增子的機會。
對于基因分型和其他需要高鑒別度的應用，有一種新型高選擇性 DNA 聚合酶 SNP Pol DNA 聚合酶 >。它特異性地區分錯配的引物模板復合物，并特異性地僅提供具有*全匹配引物對的 PCR 產物。
對于實時定量 PCR >，有高度專業化的 qPCR 預混液。在這里，選擇合適的預混液取決于所使用的 qPCR 設備。例如，重要的是要注意 qPCR 預混液中是否應包含 ROX 以及應包含多少 ROX，以及它是帶有綠色熒光染料>的 Green qPCR Mastermix 還是不含熒光染料的 Probe qPCR MasterMix >。也可提供在室溫下穩定的微珠凍干 （LyoBalls >）。
PCR 反應中使用的 DNA 聚合酶量會顯著影響 PCR 結果（對于 50 μL 方法，使用 1.25 - 1.5 單位 Taq 聚合酶>）。
退火
退火溫度應通過溫度梯度進行優化。退火期也會影響成功。確實，使用不同的預混液或使用其他供應商的反應緩沖液會對退火溫度產生嚴重影響。
引物對的兩種引物的熔解溫度相差不應超過 5°C。
典型的退火溫度比所用引物的*低 Tm 低約 5°C。溫度通常下降到 50-60°C 之間。
如果存在非特異性條帶或潤滑，則應測試更高的退火溫度。
典型的退火時間在 15-30 秒范圍內。
延伸溫度和時間
擴增子延伸通常在 68°C 下進行。
作為一般規則，可以假設每 1000 個堿基對的標準 Taq 聚合酶在 68°C 下的延伸時間為 1 分鐘（或 2000 個堿基對為 2 分鐘，或 3000 個堿基對為 3 分鐘）。
對于小于 1 kb 的 PCR 產物，可以采取 45-60 秒（如果不是接近 1 kb 的擴增子，則更像是 45 秒）。
超過 3000 個堿基對的 PCR 產物和超過 30 個循環的 PCR 方案都可能需要更長的延伸時間。因此，應再次優化更長的擴增子或更高的循環數。
擴增具有高 GC 含量、強二級結構、低濃度或大于 5 kb 的擴增子的模板通常需要優化 PCR 條件。通常，在 PCR 過程中應在 95°C 下進行 15-30 秒的變性。
上海牧榮生物科技有限公司 是一家專注于分子生物學、細胞生物學、細菌學、遺傳學、免疫學、生物化學、蛋白質學、細胞治療、臨床應用等領域，以銷售為主的生物技術公司。銷售的產品涉及，細胞株和菌株、胎牛血清、生化試劑、ELISA試劑盒、抗體和抗原、細胞因子、技術服務、實驗耗材和消耗品、儀器設備等。客戶遍布大學、研究所、醫院、衛生防疫、商品檢驗檢疫、制藥公司、生物技術公司和食品工業等單位。
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